甘松提取物对单个兔心室肌细胞钾通道的影响
唐其柱黄峥嵘吴钢王腾沈涤非
医院心内科湖北武汉
利用全细胞膜片钳记录技术研究甘松提取物（NcBe）对兔单个心室肌细胞延迟整流钾电流（Ik）、瞬时外向钾电流(Ito)和内向整流钾电流(Ik1)的影响。结果显示：在刺激电压+50mV时，5g/L和10g/L的甘松提取物使Ik尾电流（Ik-tail）幅值从(0.48±0.04)pA/pF分别降至(0.38±0.03)pA/pF和(0.28±0.02)pA/pF（n=9,p均0.05），抑制率分别为20.9%和41.6%；在刺激电压+60mV时，5g/L和10g/L的甘松提取物使瞬时外向钾电流(Ito)幅值从(4.3±0.41)pA/pF分别降至(2.5±0.22)pA/pF和(1.3±0.11)pA/pF（n=7,p均0.01），抑制率分别为41.9%和69.8%；甘松提取物对内向整流钾电流(Ik1)的电流幅值和反转电位的影响不明显(n=7,p0.05)。结果表明甘松提取物对Ik和Ito均有浓度依赖性阻滞作用，这可能是其抗心律失常又一重要机制。
甘松膜片钳钾通道心室肌细胞兔
EffectofNardostachyschinensisBatalextractonpotassiumcurrentinrabbitventricularmyocytes.TANGQizhu,HUANGZhengrong,SHIXiteng,etal.(DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity.Wuhan,China)
ObjectivetoinvestigatetheeffectofNardostachyschinensisBatalextract(NcBe)ondelayedrectifierpotrssiumcurrent(Ik)、transientoutwardpotassiumcurrent(Ito)andinwardrectifierpotassiumcurrent(Ik1)inrabbitventricularmyocytes.MethedsWholecellpatchclamptechniquewasused.Resultes(i)NcBedecreasedIktailcurrentamplitudeinadose-dependentmanner.At5g/LNcBe,Iktailcurrentamplitudewassignificantlydeseasedfrom30mVtomorepositivepotentials:(0.48±0.04)pA/pFto(0.38±0.03)pA/pF(n=9,p0.05)at50mV;at10g/L,thecurrentdensitywassignificantlyreducedfrom20mVtomorepositivepotentials:(0.48±0.04)pA/pFto(0.28±0.02)pA/pF(n=9,p0.05)at50mV.(ii)At60mV,NcBeat5g/Land10g/LdecreasedItocurrentamplitudefrom(4.3±0.41)pA/pFto(2.5±0.22)pA/pFand(1.3±0.11)pA/pF（n=7，p0.01,respectively）;(iii)NcBedidnotinhibitIk1withnochangeonreversal-potential(n=7,p0.05).ConclusionsNcBeblocksIkandItoinaconcentrationdependentmanner,whichmaycontributetoitsantiarrhythmiceffect.
NardostachyschinensisBatalPatchclampPotassiumcurrentVentricularmyocyteRabbit
甘松为败酱科植物甘松（NardostachyschinensisBatal）或匙叶甘松（NardostachysjatamansiDC.）的干燥根及根茎。具有理气止痛，开郁醒脾之功效。动物实验和临床实践表明甘松具有抗心律失常作用[1-3]，但其抗心律失常的电生理机制目前尚不清楚。本实验采用膜片钳全细胞技术研究甘松提取物对兔单个心室肌细胞延迟整流钾电流（Ik）、瞬时外向钾电流(Ito)和内向整流钾电流(Ik1)的影响，探讨其抗心律失常的离子机制。
1.材料与方法
1.1心室肌细胞分离
按文献[4，5]报道的酶解法分离兔单个心室肌细胞。取健康新西兰大耳白兔，体重1.5~2.0kg，雌雄不限（武汉大学医学院实验动物中心提供）。用3%戊巴比妥钠（30mg/kg）静脉注射麻醉，肝素钠IU/Kg经耳缘静脉注射抗凝固。10-15min后迅速开胸取出心脏，在％氧饱和的0℃生理盐水中轻轻挤压心脏排出心腔内残余血液，减去心包以及周围结缔组织后，连接于改良的Langendorff心脏灌流装置上，经主动脉逆行灌流。用无钙台氏液灌流（灌流压约70mmHg，循环水浴使灌流液保持37℃）3-5min，冲洗出心脏内残留血液并使心脏停跳。用含钙0.2mmol/L和Ⅰ型胶原酶（0.33g/L）的低钙台氏液反复灌流5-8min，至心脏膨大、松弛。从灌流装置上取下心脏，剪除心房、室间隔和乳头肌，留下心室肌组织块置于盛有含酶低钙台氏液的烧杯中充分剪碎。37℃温孵10min后，用含10%BSA的低钙台氏液稀释四倍，42μm的尼龙滤网过滤后收集含单个心室肌细胞的悬液并逐渐复钙，于室温下保存备用。
1.2全细胞膜片钳记录
采用Hamill等[6]方法进行全细胞膜片钳记录实验。用滴管吸数滴细胞保存液加入2ml的灌流槽中，放置在倒置显微镜（IMT-2,Olympus）工作台上，待细胞沉淀贴壁8~10min后，用含%饱和氧的细胞外液以BPS-4灌流装置灌流，流速1.5~2ml/min。选取边缘整齐，横纹清晰，表面无颗粒，无收缩的细胞作为实验对象。玻璃毛坯（中科院上海神经研究所）经微电极拉制仪（pp-83,Narishige）二步法拉制成尖端为1-1.5μm的电极，电极充灌内液，入水阻抗为2-3MΩ。补偿液接电位，调节三维操纵器(MO-,Narishige)使电极尖端移向细胞表面，再进行封接，当阻抗达到1GΩ以上，补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式，调节慢电容补偿和串联电阻补偿以减少瞬时充放电电流和钳制电位误差。在电压钳制模式下，根据钳制电位的不同，分别测量不同的离子通道电流。膜片钳放大器（EPC-9,德国HEKA）与计算机相连，信号的发放和采集均由Pulse+pulsefit8.31软件完成并存储在硬盘内，供测量和分析用。
1.3溶液与试剂
正常Tyrode液成分（mmol·L-1）：NaCl；KCl5.4；CaCl21.8；MgCl21.0；NaH2PO40.33；HEPES10；Glucose10；PH用NaOH调至7.40；无钙Tyrode液为正常Tyrode液中不加CaCl2，低钙Tyrode液CaCl2仅为0.2mmol·L-1，其他成分均与正常Tyrode液成分相同。记录K+电流的电极内液成分（mmol·L-1）：KCl45；K-aspartate85；Na-pyryruvate5.0；MgATP5.0；EGTA10；HEPES10；Glucose11；PH用KOH调至7.40；记录K+电流的电极外液成分无钙Tyrode液。
本实验采用的甘松提取物由步长制药集团提供，为1：12规格的甘松水提取物。Collagenase(TypeI)、BSA、K-aspartate、Na-pyryruvate、MgATP、HEPES、EGTA均为Sigma产品。TTX购自河北水产研究所。其余试剂均为国产分析纯。
1.4数据处理及统计分析
电生理学资料由Pulse+Pulsefit8.31进行处理，所有数据均以±s表示，通过SPSS11.0软件进行数据分析,用药前后比较采用配对t检验，不同组间差异用方差分析，以P0.05为组间差异有统计学意义。
2.结果
2.1甘松提取物对延迟整流钾电流的作用
于细胞外液加μMCdCl2阻断ICa，L，μMBaCl2阻断Ik1,50μMTTX阻断INa。保持电压为-50mV，施与-40mV至+70mV，跃阶10mV，频率0.1Hz,5s的去极化脉冲，复极至-30mV，可记录到一缓慢激活的外向性电流和尾电流，为延迟延迟整流钾电流（IK）及其尾电流(Ik-tail)。去极化电位为-30mV时，IK-tail即被激活。测定稳态电流与尾电流顶端的高度差表示IK-tail的大小。在+50mV时IK-tail达最大。在+50mV,对照组、5g/L甘松提取物组、10g/L甘松提取物组IK-tail幅值分别为(0.48±0.04)pA/pF、(0.38±0.03)pA/pF和(0.28±0.02)pA/pF（n=9,p均0.05），抑制率分别为20.9%和41.6%。见图1。以各脉冲下IK-tail电流密度幅值对相应的膜电位作图得I-V曲线。不同浓度甘松提取物使不同膜电位水平Ik-tail均减小，I-V曲线下移。见图2。
图1NcBe对心室肌细胞Ik电流的影响：A为对照；B为5g/LNcBe;C为10g/LNcBe
图2NcBe对心室肌细胞Ik-tailI-V曲线的影响
2.2甘松提取物对瞬时外向钾电流的作用
保持电位-80mV，施与-40mV，20ms的预刺激，紧接着给予-40~+60mV，跃阶10mV,ms的脉冲，刺激频率0.2Hz,记录Ito。其可被2mmol/L4-AP完全阻断。Ito的幅值取峰电流值与除极脉冲结束时电流值之差。Ito自-30mV开始激活，随膜电位去极化程度增加而增加。指令电压为+60mV时，5g/L、10g/L甘松提取物分别使Ito幅值从(4.3±0.41)pA/pF分别降至(2.5±0.22)pA/pF和(1.3±0.11)pA/pF（n=7,p均0.01），抑制率分别为41.9%和69.8%。见图3。以各脉冲下电流密度幅值对相应的膜电位作图得I-V曲线。不同浓度甘松提取物使不同膜电位水平Ito均减小，I-V曲线下移。见图4。
图3NcBe对心室肌细胞Ito电流的影响A为对照B为5g/LNcBeC为10g/LNcBe
图3NcBe对心室肌细胞ItoI-V曲线的影响
2.3甘松提取物对内向整流钾电流的作用
保持-40mV，施与ms，阶跃10mV，-~+40mV的方波刺激，得到一系列不随时间改变的稳态电流，即Ik1。超极化时为内向电流，电流幅值较大，去极化时该电流转变为外向电流，呈现很强的内向整流特性。10g/L甘松提取物对Ik1电流幅值无明显影响(19.9±1.2pA/pFvs19.8±1.1pA/pF，n=7,p0.05),也不改变其反转电位，均为-70mV，见图5。
图5NcBe对同一心室肌细胞Ik1电流的影响：A为对照，B为10g/LNcBe
3.讨论
本实验采用膜片钳技术直接记录甘松提取物对兔单个心室肌细胞延迟整流钾电流（Ik）、瞬时外向钾电流(Ito)和内向整流钾电流(Ik1)的影响，结果表明甘松提取物对Ik和Ito有浓度依赖性抑制作用，对Ik1无明显影响。
近年来的研究表明，在哺乳动物心肌细胞存在瞬时外向钾电流(Ito)，它是心肌复极早期重要的钾电流之一，在动作电位（AP）复极1期起重要作用[7-9]对AP的形态和时程有较大的影响[10]。Ito分为两型：Ito1（对4-AP敏感的、非钙离子依赖型）和Ito2（钙激活的氯电流、钙离子依赖型）。为了研究Ito1，实验过程中阻断了正常情况下掩盖Ito的钠电流和L-型钙电流，并且在电极内液里加了10mmol/LEGTA，以保证所记录到的Ito是Ito1。
许多种属动物的心肌电生理特征表现为跨壁不均一性，这种差异是理解心肌电生理特征和心律失常产生机制的重要因素。哺乳动物的心室肌细胞按电生理特征不同可分为外膜层、内膜下层和中层细胞（M细胞），Ito1主要分布在外膜层和中层细胞，而内膜下层分布较少。Ito1的这种跨壁分布梯度构成了心室肌跨壁不均一性的重要特征，因此Ito也成为药物作用的靶点之一。消除/减少Ito的跨壁梯度，减轻心肌跨壁不均一性将会减少心律失常的发生。
延迟整流钾电流（Ik）亦是重要的复极电流，是动作电位2、3期主要的复极电流。根据动物种属的不同，延迟整流钾电流（Ik）可分为快激活的延迟整流钾电流（Ikr）和慢激活的延迟整流钾电流（Iks）。延迟整流钾电流（Ik）也是III类抗心律失常药物的作用靶点。一些新的III类抗心律失常药物选择性阻断Ik的快成分(Ikr)，表现出很强的逆使用依赖性，即频率加快时药物延长动作电位时程（APD）的作用减弱，而频率减慢时作用增强，导致APD过度延长，诱发LQT综合征，致心律失常危险性增高。因此有人建议使用非选择性的III类抗心律失常药物，研究表明非选择性III类抗心律失常药物比选择性III类抗心律失常药物表现出较弱的逆使用依赖性[11,12]。
近年来，有学者[13]对III类抗心律失常药物提出了新的观点：认为阻断包括Ik在内的多个重要的复极电流更有利于减少III类抗心律失常药物的致心律失常作用,并进一步提出了阻断Ito的药物替代III类抗心律失常药物可能性的问题,为寻找新的抗心律失常药物提供了新的思路。
本实验结果表明甘松提取物对Ik和Ito均有抑制作用，这可能是其抗心律失常作用的又一重要机制，并且其抗心律失常作用可能优于III类抗心律失常药物。本实验还发现小于1g/L的甘松提取物对Ik、Ito和Ik1几乎没有影响,而大于10g/L甘松提取物会导致大部分细胞死亡,因此实验过程中所采用的甘松提取物浓度限制在1g/L~10g/L这个比较狭窄的范围内。
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